原代細胞(primaryculturecell)是指從機體取出后立即培養(yǎng)的細胞。有人把培養(yǎng)的第1代細胞與傳10代以內(nèi)的細胞統(tǒng)稱為原代細胞培養(yǎng)。原代細胞不僅廣泛應(yīng)用于分子、細胞生物學和生物醫(yī)學基礎(chǔ)研究,如蛋白質(zhì)組學、基因組學、細胞株(系)研究、DNA,RNA和遺傳學研究等,還可應(yīng)用于當今熱門的生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。
細胞轉(zhuǎn)染是將外源性基因?qū)爰毎麅?nèi)的一種專門技術(shù)。隨著基因與蛋白功能研究的深入,轉(zhuǎn)染目前已成為實驗室工作中經(jīng)常涉及的基本方法。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬于通過物理方法將基因?qū)爰毎姆独?;化學介導方法很多,如經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法、和多種陽離子物質(zhì)介導的技術(shù);生物介導方法,有較為原始的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)染,和現(xiàn)在比較多見的各種病毒介導的轉(zhuǎn)染技術(shù)。
原代細胞細胞轉(zhuǎn)染的實驗操作要注意的事項:
1.轉(zhuǎn)染試劑的準備
?、賹?00ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。
?、谡鹗幒髮⒃噭┓旁冢?0攝氏度保存,使用前還需震蕩。
2.選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質(zhì)體體積:DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,再次震蕩。
3.將混合液在室溫放置10―15分鐘。
4.吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。
5.加入混合液,將細胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。
6.到時后,根據(jù)細胞種類決定是否移除混合液,之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。
三、第二次細胞傳代
1.在轉(zhuǎn)染后24小時,觀察實驗結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。
2.再次進行細胞傳代,按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養(yǎng)皿將細胞重新轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中。
3.在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。